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在使用超濾離心管時您所需要注意的事項分析
點擊次數(shù):2667 更新時間:2020-03-11
  新買來的超濾離心管是干燥的,使用前加入超純水,水量*過膜,冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,加入蛋白液前,需要插在冰上預(yù)冷。
  不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速rpm換算成g之后,有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,減小對膜的壓力。注意,一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,方可離開離心機(jī),否則離心機(jī)出問題時,無法快速處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整。在實際使用中,一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。
  當(dāng)濃縮到剩下1ml時,取50ul緩沖溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍(lán)色,以此判斷超濾離心管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,用5mgml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮,直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾離心管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的緩沖溶液,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
  前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer,再濃縮至1ml左右,連續(xù)三次,后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達(dá)到1000倍以上,基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
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